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HPLC



HPLC steht für High Performance Liquid Chromatography (in den Anfangszeiten dieser Technik auch für "High Pressure Liquid Chromatography"). Das deutsche Wort Hochdruckflüssigkeitschromatographie wird nur sehr selten verwendet. Es handelt sich um ein chromatographisches Trennverfahren, bei dem die zu untersuchende Substanz zusammen mit einem flüssigen Laufmittel, der "mobilen Phase" (auch "Eluent" genannt) auf eine sog. Trennsäule, die die "stationäre Phase" darstellt, gegeben wird. Wechselwirkt ein Bestandteil der zu untersuchenden Substanz stark mit der stationären Phase, verbleibt er relativ lange in der Säule. Wechselwirkt er hingegen schwach mit der mobilen Phase, verläßt er die Säule früher. Je nach Stärke dieser Wechselwirkungen erscheinen die Bestandteile der Substanz zu verschiedenen Zeiten (den "Retentionszeiten") am Ende der Trennsäule, wo sie dann mit einem geeigneten Detektor nachgewiesen werden können. Es werden zwei Methoden unterschieden: Normal Phase (NP) und Reversed Phase (RP). Bei der NP-HPLC wird eine polare stationäre Phase(z.B. Silikagele/Kieselgel) und eine unpolare mobile Phase (z.B. Hexan) genutzt. Polare Moleküle werden auf der Säule länger retardiert (zurückgehalten) als unpolare Moleküle und verlassen deshalb später die Säule. Die RP-HPLC ist in der Praxis die gängigste Methode. 70% aller analytischen HPLC-Trennungen sind RP-Trennungen. Hier wird eine unpolare stationäre Phase verwendet und eine polare mobile Phase. Die stationäre Phase wird hergestellt indem man Silane welche mit langkettigen Kohlenwasserstoffen substituiert wurden, mit Silicagel reagieren läßt. Dabei wird die polare Oberfläche der Silicagel-Partikel mir einer apolaren Schicht aus Alkanen überzogen, also die Polarität umgekehrt (engl.: "Reversed") . Als mobile Phase werden meist Mischungen aus Wasser oder Puffer und Acetonitril, Tetrahydrofuran (THF) oder Methanol eingesetzt. Bei isokratischen Trennungen bleibt die Zusammensetzung der Mobilen Phase während der gesamten Zeit gleich. Bei Gradiententrennungen wird der unpolare Anteil während der Analyse erhöht.

Besondere Anwendung findet die RP-HPLC bei der Auftrennung von polaren Analyten die auf Normalphasen zu hohe Retentionszeiten aufweisen würden. Dafür wird meist eine C18-Säule (also ein Octadecylsilan als Derivatisierungsreagenz für das Silicagel) eingesetzt, die Detektion erfolgt zumeist mittels UV- oder Fluoreszenzdetektor.

Detektoren

UV-Detektor
Diodenarraydetektor(DAD)
Lichtstreudetektor
Fluoreszenzdetektor
Brechungsindexdetektor
Massenspektrometer



     
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