Gelelektrophorese
Gelelektrophorese ist eine analytische Methode der Chemie, um verschiedene Arten von Molekülen zu trennen. Dabei wandert eine Mischung aus zu trennenden Molekülen unter Einfluss eines elektrischen Felds (siehe dazu: Elektrophorese) durch ein Gel, welches in einer ionischen Pufferlösung liegt. Je nach Größe und Ladung der Moleküle bewegen sich diese unterschiedlich schnell durch das Gel. Dabei wandern kleine, negativ geladene Moleküle (Anionen) am schnellsten in Richtung der positiv geladenen Anode und positiv geladene Moleküle (Kationen) in Richtung der negativ geladenen Kathode.
Table of contents |
2 Durchführung 3 Auswertung 4 Einsatzgebiete |
Gel-Matrix
Die Bestandteile des Gels, z.B. Agarose (ein hochreiner Algenextrakt) oder polymerisiertes Acrylamid (eine krebserregende Substanz), bilden ein engmaschiges Netzwerk, das die zu trennenden Moleküle bei ihrer Wanderung im elektrischen Feld behindert.
Agarose-Gele sind relativ großporig (150 nm bei 1%igen, 500 nm bei 0,16%igen Gelen) und eignen sich gut zur Trennung von DNA und hochmolekularen Proteinen. Polyacrylamid-Gele weisen wesentlich kleinere Poren auf (3-6 nm). Die Porengröße hängt von der Acrylamidkonzentration und dem Vernetzungsgrad ab.
Je nach Anwendung werden dem Gel verschiedene Zusatzstoffe zugesetzt, z. B. SDS bei der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) oder Ampholyte bei der Isoelektrischen Fokussierung (IEF).
Gele können ohne großen Aufwand selbst hergestellt werden. Fertige Gele und die entsprechenden Puffersysteme können zudem kommerziell erworben werden.
Bei der Gelelektrophorese entsteht Wärme. Diese muss abgeführt werden, um optimale Bedingungen zu gewährleisten. Deswegen sollte die Gelelektrophorese in gekühlten Apparaturen bei konstanten Temperaturen durchgeführt werden, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
Im Idealfall wird die Elektrophorese beendet, wenn die kleinsten bzw. mobilsten Moleküle das Ende des Gels erreicht haben. Das garantiert die höchstmögliche Auftrennung der Moleküle.
Ethidiumbromid wandert unglücklicherweise zum negativen Pol, wodurch sich das "untere" Ende des Agarose-Gels entfärbt und schwache Banden dann nicht mehr erkennbar sind. Ein Ausreizen der gesamten Gellänge ist hier suboptimal.
Gleiche Moleküle laufen in diskreten Zonen - umgangssprachlich als Banden bezeichnet - durch das Gel. Mehrere Proben können parallel nebeneinander gleichzeitig durch das selbe Gel laufen. Ist die Größe einiger Moleküle bekannt, kann man durch Vergleich von deren Banden mit den restlichen Banden die Größe der anderen Moleküle abschätzen. Solche Molekulargewichtsstandards sind kommerziell erhältlich.
Eine Bestimmung der Menge einer Substanz in einer Bande bzw. der relative Anteil einer Bande (siehe: Quantifizierung) ist nach der Färbung des Gels und einer anschließenden densitometrischen Auswertung möglich.
Durchführung
Die klassische Gelelektrophorese wird als Zonenelektrophorese durchgeführt. Eine Methode zur Erzielung einer höheren Auflösung ist die diskontinuierliche Elektrophorese.Auswertung
Zur Auswertung des Gels nach der Elektrophorese werden die zu trennenden Moleküle entweder vor der Elektrophorese radioaktiv markiert und anschließend in einer Autoradiographie nachgewiesen oder nach der Elektrophorese mit verschiedenen Farbstoffen wie z.B. Ethidiumbromid "gefärbt" und unter UV-Licht betrachtet. So verfährt man etwa mit DNA-Fragmenten. Proteine können angefärbt werden (siehe dazu: Färbung nach Fairbanks, Silberfärbung) und/oder immunologisch nachgewiesen werden (Western-Blot).Einsatzgebiete
Gelelektrophorese wird in der Genetik und der Biochemie häufig verwendet:
Gelelektrophorese | Variante | Einsatzgebiet |
Agarose-Gelelektrophorese | Analytik von Desoxyribonukleinsäure (DNA) Ribonukleinsäure (RNA) 1 | |
Nativ-Gelelektrophorese | Saure Nativ-Gelelektrophorese Blaue Nativ-Gelelektrophorese | Proteinanalytik 2 |
SDS-PAGE | 2D-Gelelektrophorese | Proteinanalytik 2 |
Isoelektrische Fokussierung | Proteinanalytik 2 | |
1siehe auch: Southern-Blot, Northern-Blot
2siehe auch: Western-Blot